獼猴桃花粉活力測定條件的優(yōu)化研究a

獼猴桃花粉活力測定條件的優(yōu)化研究A
作者：徐達，王夢欽，董云龍，張云峰(云南師范大學生命科學學院 云南生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程中心)
摘要：人工輔助授粉是獼猴桃優(yōu)產高效栽培的重要保障之一，而花粉質量是其中最為重要的限制因素。本研究以不同電商平臺銷售的獼猴桃花粉為材料，基于正交試驗、響應面試驗設計對TTC法測定獼猴桃花粉活力的條件進行優(yōu)化，同時對萌發(fā)率、授果率與花粉活力進行相關性分析。結果表明，不同電商銷售的花粉在花粉數(shù)量、花粉活力、萌發(fā)率及坐果率上均存在較大差異；TTC法檢驗獼猴桃花粉活力的最佳條件為TTC濃度、染色溫度、染色時間分別為0.7%、30℃、25min；花粉萌發(fā)最佳條件為0.2%硼酸、15%蔗糖；在獼猴桃人工授粉過程中，花粉萌發(fā)率與坐果率的相關性最高，而花粉活力與萌發(fā)率并非完全一致；部分電商平臺銷售花粉的花粉活力低、坐果率低。因此，在互聯(lián)網(wǎng)背景下，涉及農業(yè)生產的相關產品應加強管理。
關鍵詞：獼猴桃，花粉量，花粉活力，離體萌發(fā)，響應面分析

▲獼猴桃雌花、獼猴桃雄花

Study on the Condition Optimization for Pollen Vitality Test of Kiwifruit
Abstract: Artificial supplementary pollination is one of the important technical guarantees for efficient cultivation of kiwifruit, and the pollen quality is the top limiting factor for artificial pollination during the cultivation. Based on the orthogonal experiment and the response surface design, the condition optimization for pollen vitality test with TTC staining was studied with differential pollen samples of kiwifruit purchased from ecommerce platforms. Meanwhile, the correlations of pollen vitality with in vitro germination rate of pollen and fruit setting rate were analyzed. The results showed that the pollen amount, pollen vigor, germination rate and fruit setting rate had obvious differences among the pollen samples. The best condition for TTC staining test of kiwifruit pollen vitality was TTC concentration of 0.7%, dyeing temperature of 30℃, and dyeing time of 25 min. The optimum condition for pollen germination was boric acid of 0.2% and sucrose content of 15%. The results also showed that the pollen germination rate and fruit setting rate had high correlation during artificial pollination, but the pollen vitality and the germination rate was not well consistent. And some pollen samples bought from e-commerce platforms had low pollen vitality and low fruit setting rate. Therefore, the on-line business of agricultural production materials should be well managed and supervised.
Keywords: kiwifruit; pollen amount; pollen vitality; in vitro germination; response surface analysis

▲testing pollen

引言
獼猴桃也稱奇異果，為獼猴桃科獼猴桃屬的植物果實。全世界共發(fā)現(xiàn)66個種、約118個分類單元，其中中國有62個種，獼猴桃資源極為豐富。1904年新西蘭從中國引種獼猴桃，隨后選育出多個優(yōu)良品種(系)。經100多年的發(fā)展，獼猴桃不僅成為目前全世界野生馴化最為成功的水果之一，也成為品種多樣程度高、世界流行水果之一。《中國獼猴桃產業(yè)發(fā)展報告(2020)》的數(shù)據(jù)顯示，獼猴桃的栽培已廣布于世界5大洲23個國家和地區(qū)，截至2020年，全球獼猴桃種植面積達到28萬hm，全球獼猴桃產量為451.8萬t。中國獼猴桃種植面積達到19.3萬hm，產量為229.1萬t，無論種植面積還是產量都是穩(wěn)居世界第一。

▲獼猴桃公花采收

作為雌雄異株植物，獼猴桃的天然授粉坐果率極低，外加雌雄株花期不遇、天氣影響等原因致使僅依靠天然授粉很難獲得高質優(yōu)效的栽培效果，人工輔助授粉成為獼猴桃優(yōu)產高效栽培中極為重要技術手段。山區(qū)栽培獼猴桃，由于栽培面積小、栽培分散，獼猴桃栽培果農的花粉或購于電商平臺，或由技術合作單位供給。而花粉在采集、保存中受多種因素的影響，其活力、萌發(fā)率、授精率都不穩(wěn)定，給果農的生產帶來極大風險。目前對獼猴桃花粉的研究主要集中花粉對果實品質影響、活力測定及其影響因素、花粉培養(yǎng)、花粉散粉規(guī)律、花粉萌發(fā)與外界環(huán)境的關系叫等方面。在花粉質量控制方面，尤其是對電商平臺所售花粉的質量評價及采用何種指標有效判定獼猴桃授精情況缺乏研究。本研究以不同電商平臺銷售的獼猴桃花粉為材料，基于正交試驗、響應面試驗設計對TTC法測定獼猴桃花粉活力的條件進行優(yōu)化，對花粉的萌發(fā)率、坐果率與花粉活力間的相關性做分析，以期為后續(xù)的研究和生產提供指導。

▲獼猴桃花粉活力測定條件的優(yōu)化研究

1 材料與方法
1.1材料
試驗材料為購于電商平臺的獼猴桃花粉5份，其中2份由云南建水良豐農業(yè)生物技術公司所提供，另外3份由實驗室選購。電商平臺銷售的獼猴桃花粉價格不一、評價差異大、選購次數(shù)不同，價格一般在10~30元/g，選購次數(shù)可從幾次到10萬次。為此，選購時按好評優(yōu)先及購買次數(shù)優(yōu)先的原則進行選購，價格在18~26元/g；同時記錄好評數(shù)、價格及購買次數(shù)。所有花粉樣品在試驗期間存放于4℃冰箱保存。
1.2 花粉數(shù)量檢驗及TTC染色法活力測定
取10mg花粉樣品置于1mL蒸餾水中，混合均勻。隨后取1μL混合液置于顯微鏡下觀察花粉細胞數(shù)目及活力檢驗。1μL花粉懸浮液相當于10μg的購買花粉(其中包括輔料)?；ǚ刍盍Σ捎肨TC染色法進行檢驗，檢驗參照張鴻等的方法。為進一步優(yōu)化活力測定，采用正交和響應面進行設計。在正交設計及響應面設計中采用3因子3水平設計，因子包括 TTC濃度(A,0.3%、0.5%、0.7%)、染色溫度(B,20、25、30℃)、染色時間(C,20、25、30min)。

▲恒溫震蕩氣育培養(yǎng)箱檢測獼猴桃花粉活性

1.3 離體萌發(fā)培養(yǎng)液的優(yōu)化
在蒸餾水中分別配制蔗糖溶液為5%、10%、15%、20%和硼酸溶液為0.1%、0.15%、0.2%的組合萌發(fā)液。將稀釋不同倍數(shù)的花粉置于花粉萌發(fā)液中，隨后在溫度為(25±2)℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，在顯微鏡下觀察，以花粉管長度大于花粉直徑作為花粉萌發(fā)的判定標準。

1.4 授粉試驗
采用臣風果樹電動授粉機進行授粉。選擇天氣晴朗的8:00-10:00進行授粉。授粉在云南建水良豐農業(yè)生物技術公司的獼猴桃栽培基地進行，按說明書將混有輔料的獼猴桃花粉加入授粉器，以點授法對雌花花柱授粉，做好標記，授粉只進行1次，后期以坐果數(shù)統(tǒng)計坐果率，坐果率= 坐果數(shù)/授粉花朵數(shù)x100%

1.5 數(shù)據(jù)處理
運用Excel、SPSS 26.0和Design Expert 8.0.6對試驗數(shù)據(jù)進行描述統(tǒng)計、差異顯著性檢驗，對花粉活力進行分析。

▲獼猴桃花粉活力測定條件的優(yōu)化研究

2 結果與分析
2.1 TTC染色花粉活力的正交試驗結果
從5份花粉中選取2份由云南建水良豐農業(yè)生物技術公司所提供的獼猴桃花粉，對其進行花粉數(shù)量、萌發(fā)率、花粉活力進行測定，花粉活力的測定條件為TTC濃度0.7%、染色溫度25℃、染色時間30min。表1的結果表明，2批獼猴桃花粉在花粉數(shù)量、萌發(fā)率及花粉活力均存在顯著性差異。為優(yōu)化花粉活力的檢驗條件，進行正交設計試驗(表2)。表2顯示TTC濃度、染色溫度、染色時間分別為0.7%、30℃、30min(處理7)的花粉活力最高(97%)，而TTC濃度、染色溫度、染色時間分別為0.3%、20℃、20min(處理1)的花粉活力最低(22%)。

▲獼猴桃花粉活力測定條件的優(yōu)化研究

方差分析(表3)顯示，TTC濃度、染色溫度、染色時間的P值分別為0.021、0.033、0.026，所有P值均小于0.05，表明這些因素對TTC檢驗花粉活力均有顯著性影響。在15%蔗糖、0.15%硼酸、培養(yǎng)時間24h下進行花粉萌發(fā)檢驗(圖1)，結果顯示2批花粉的萌發(fā)率也存在差異，在5、10、24h的萌發(fā)率均存在顯著性差異，且花粉數(shù)量多的樣品萌發(fā)率并不高。

2.2 TTC 染色花粉活力響應面優(yōu)化
為進一步優(yōu)化TTC染色花粉活力檢驗的條件，基于Design Expert進行試驗設計，結果見表4。對響應面設計結果進行統(tǒng)計分析(表5)，模型F=5.75，且P≤0.05，表明模型差異顯著。校正決定系數(shù)R2=0.7278，相關系數(shù)R2=0.8809，表明該模型的擬合度較好，可用于花粉生活力的檢驗。模型的變異系數(shù)為9.6%(<10%)，表明模型穩(wěn)定性良好，試驗操作可靠。模型的信噪比為7.834(>4)，表明該模型能真實地反映試驗結果。同時發(fā)現(xiàn)，響應面法測定獼猴桃花粉生活力TTC法測定的最佳條件為TTC濃度0.7%、染色溫度30℃、染色時間25min，結果與正交試驗一致。經回歸分析得回歸方程，如式(2)。

花粉活力=73.00+10.13A-0.37B+3.00C+7.75AB-4.50AC+1.00BC+6.12A2-8.38B2-10.63C……..(2)式中，A、B、C分別為TTC濃度、染色時間、染色溫度。
依回歸模型分析，經Design-Expert V8.0.6.1軟件對TTC濃度、染色時間及染色溫度3個因素進行分析，得到對應的等高線圖及響應曲面圖(圖2)。

在DesignExpert軟件分析中，等高線的形態(tài)可直觀反映出因素間交互作用的大小，圓形表示交互作用小，橢圓形則相反叫，而響應面的坡度變化則可反映出各因素對響應值的影響力，坡度越緩表明影響越小。從圖2可看出，TTC濃度、染色時間及染色溫度三者間的互作較為復雜，染色溫度與TTC濃度的交互作用對響應值影響最大，響應面的傾斜度最高，其次是染色時間與 TTC濃度，最后是染色溫度與染色時間。

2.3 花粉離體萌發(fā)、授粉及其與活性的相關性
為驗證花粉活力與花粉離體萌發(fā)、授粉間相關性，選擇蔗糖、硼酸溶液對獼猴桃花粉進行離體萌發(fā)，蔗糖濃度設定為5%、10%、15%、20%，硼酸濃度為0.1%、0.15%、0.2%，花粉選擇活力較高的B公司。結果見圖3。蔗糖濃度和硼酸濃度分別為15%、20%，0.15%、0.2%時，獼猴桃的花粉萌發(fā)較高，其中15%蔗糖條件下萌發(fā)率最高，但在硼酸濃度分別為15%、20%條件下，其萌發(fā)率并無顯著性差異。因此，可將15%蔗糖、15%硼酸作為獼猴桃花粉的最佳萌發(fā)條件。

表6顯示，5批花粉雖在花粉數(shù)量上差異不顯著，但花粉活力、萌發(fā)率、坐果率均表現(xiàn)出顯著性差異。尤其是坐果率的差異會嚴重影響到獼猴桃的產量。對花粉活力、萌發(fā)率和坐果率之間相關性進行計算，得出花粉活力和萌發(fā)率相關系數(shù)為0.667，萌發(fā)率和坐果率相關系數(shù)為0.928，花粉活力和坐果率相關系數(shù)為0.843。

因此，坐果率在很大程度上取決于萌發(fā)率(表7)。研究表明,利用獼猴桃花粉萌發(fā)率顯示其花粉活力更為合理，萌發(fā)率的測定雖不復雜，但測定時間相對長。同時，將前期電商平臺采購時的好評、拼購次數(shù)及價格進行排位(表6)，發(fā)現(xiàn)已拼次數(shù)多、好評排位靠前的花粉，其萌發(fā)率、坐果率也較高。因此，在電商平臺選購獼猴桃花粉可首先考慮購買次數(shù)多、好評優(yōu)先的產物，其次才考慮價格。

▲packaging kiwi pollen

3 結論與討論
TTC染色是檢測種子活力、花粉活力的常用技術，其原理在于TTC可與活細胞內的琥珀酸脫氫酶產生紅色，從而以色澤判斷細胞的活力。有研究表明溫度對植物花粉的萌發(fā)具有重要的影響，因此以此設計正交試驗。張鴻等采用TTC法和I2-IK法測定花粉活力，認為TTC和I2-IK不適用于獼猴桃花粉活力的測定，并認為其原因在于獼猴桃花粉內的琥珀酸脫氫酶和淀粉含量較低，不能被染成相應的顏色。本試驗的5個樣品中，采用TTC測定法所測定的花粉活力在(45±6)%~(90.1±9)%，所有樣品都能染色，與張鴻等的結論不一致，因此TTC是否可用于獼猴桃花粉活力的檢驗也許與品種差異有關。劉成琴等報道TTC對部分植物的花粉染色效果差的原因是花粉壁太厚，染色液無法滲透，而非脫氫酶活性太低。下一步將對不同獼猴桃品種的花粉進行琥珀酸脫氫酶測定，或通過測定不同獼猴桃品種花粉璧的厚度及其對染料的透性進行補充。本試驗中，萌發(fā)率與坐果率的相關性較高(0.928)，與張鴻等的結果相吻合。從本試驗所測的5份購于網(wǎng)絡平臺的獼猴桃花粉數(shù)據(jù)來看，雖購于不同平臺的獼猴桃花粉，花粉數(shù)量上差異不大，但在花粉活力、萌發(fā)率、坐果率均存在較大差異。干燥方法、貯藏溫度、花粉來源、脫藥時間都會影響獼猴桃花粉活力。因此，在互聯(lián)網(wǎng)背景下，涉及農業(yè)生產的相關產品應加強管理，建議相關部分制定法規(guī)保障農業(yè)生產者的利益。

▲Pollen Collection獼猴桃花采集

花粉離體培養(yǎng)萌發(fā)法是檢驗花粉生活力最直接、有效的方法，離體萌發(fā)培養(yǎng)基配制主要由蔗糖、硼等營養(yǎng)成分組成。蔗糖普遍存在于植物體中，不同植物花粉萌發(fā)的最佳糖濃度差異大陽。蔗糖能夠促進植物花粉萌發(fā)和花粉管的生長，并在外部環(huán)境中保持滲透壓的平衡和穩(wěn)定。在本研究中，15%蔗糖是花粉萌發(fā)和花粉管伸長的最適濃度，這與張鴻等的研究結果有差異。一方面可能與品種相關，另一方面與試驗設計的梯度有關，在張鴻等的試驗中，其蔗糖濃度從10%直接升到了20%，無15%濃度的設置。硼是影響植物花粉萌發(fā)率高低的重要因素，硼離子能和蔗糖形成絡合物，增強糖分的吸收與代謝，極大地促進植物花粉萌發(fā)，從試驗結果可以看出，低濃度的硼酸可能會影響花粉萌發(fā)的生長，但硼酸濃度過高也可能產生較高的滲透壓，從而影響花粉萌發(fā)的生長。

▲Kiwi pollen is tested before sales

本試驗中硼的最佳濃度為0.15%，在張鴻等的試驗中，硼的最佳濃度為0.1%，其硼設置的也是從0.1%直接升到了0.2%，無0.15%濃度的設置。張偉等3在三角梅花粉萌中發(fā)現(xiàn)，不添加蔗糖或硼酸時，花粉萌發(fā)和花粉管生長極少，添加適宜硼酸和蔗糖可顯著提高花粉萌發(fā)和花粉管伸長，表明萌發(fā)需要蔗糖和硼酸共同作用。對斐濟果的研究表明Ca+濃度是影響花粉萌發(fā)的次要因素和花粉管生長的主要因素。Ca+對獼猴桃花粉萌發(fā)及花粉管生長的影響需做進一步研究。從本試驗看，萌發(fā)率均小于坐果率，其原因是否與授粉量相關也需要進一步研究。

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