獼猴桃雄株倍性差異與花粉性狀的相關(guān)性分析A

獼猴桃雄株倍性差異與花粉性狀的相關(guān)性分析
作者：廖光聯(lián)，陳 璐，鐘 敏，王斯妤，黃春輝，陶俊杰，曲雪艷，徐小彪 （江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，獼猴桃研究所，南昌 330045）

摘 要 以來(lái)源于中華獼猴桃和美味獼猴桃的48份雄株為試材，對(duì)其倍性及其花粉性狀進(jìn)行差異性檢測(cè)，并進(jìn)行聚類(lèi)分析和相關(guān)性分析。結(jié)果表明：供試的48份雄株倍性之間具有較大的差異，有2x、4x、6x 3 種倍性類(lèi)型，其中中華獼猴桃多為低倍性（2x、4x），2x占整個(gè)供試中華獼猴桃樣品總數(shù)的72.09%，變異系數(shù)為35.48%，美味獼猴桃均為6x；美味獼猴桃的花藥數(shù)整體上高于中華獼猴桃，但花粉量和花粉活力整體低于中華獼猴桃。聚類(lèi)分析表明，供試的48份雄株可分為4大類(lèi)：Ⅰ類(lèi)群花粉量變化幅度最大，所有樣品每朵花花粉量為6000～8000粒；Ⅱ類(lèi)群花藥數(shù)最多且變化幅度最大，最大花藥數(shù)與最小花藥數(shù)樣品均在此類(lèi)群中，同時(shí)該類(lèi)群還包含2x、4x、6x 3種類(lèi)型倍性；Ⅲ類(lèi)群花粉活力最高；Ⅳ類(lèi)群花粉量最高且均為2x，花藥數(shù)與花粉活力變化幅度最小。相關(guān)性分析表明，雄株倍性與花藥數(shù)之間呈極顯著正相關(guān)，其皮爾遜相關(guān)系數(shù)為 0.811。

▲一株種植在蒲江佳沃果園獼猴桃公樹(shù)

Ploidy difference and correlation analysis of pollen traits from male plants in Actinidia
Abstract： Forty-eight male plants of Actinidia chinensis and A. deliciosa which collected previously were used as experimental materials in this study. The differences in ploidy and pollen traits were detected, and the cluster analysis and correlation analysis were also carried out. The results showed that there is a big difference between the forty-eight male plants of A. chinensis and A. deliciosa, which have 2x, 4x, 6x three ploidy types. The ploidy of most of the the A. chinensis is 2x and 4x, and 72.09% of the A. chinensis is 2x, with the coefficient of variation is 35.48%. For A. deliciosa, all type of ploidy are 6x. The anther number of the A. deliciosa is higher than that of A. chinensis, while the pollen viability and pollen count of the A. deliciosa is lower than that of A. chinensis. By means of the cluster analysis, the forty-eight male plants can be divided into four major categories, of which the first category has the biggest rang of pollen count, the pollen content of all samples was concentrated within 6 000~8 000 grains. The second category has largest anther number and the biggest rang of it. The category contain the largest and the lowest anther number of sample, as the same time the three level of ploidy (2x、4x、6x) are in it. The pollen viability of the third category is the most highest and all the samples of the fourth categories are diploid, the rang of the anther number and pollen viability are smallest. Correlation analysis showed that there is a significant correlation between ploidy and anther number with the Pearson correlation coefficient is 0.811.

▲紅心獼猴桃雌花

獼猴桃（Actinidia spp.）是雌雄異株的藤蔓型果樹(shù)，生產(chǎn)中往往需要配置相應(yīng)的授粉雄株，充分的授粉將決定坐果率、果實(shí)品質(zhì)、產(chǎn)量等很多方面，并且同種花粉對(duì)不同雌株授粉時(shí)存在花粉直感效應(yīng)，這與坐果率密切相關(guān)，選擇最適合的授粉雄株對(duì)獼猴桃坐果率影響極大。目前獼猴桃以露地種植為主，在生產(chǎn)上往往因花期不遇、下雨等惡劣天氣導(dǎo)致雌株授粉不良，產(chǎn)量及果實(shí)品質(zhì)下降，僅依靠天然授粉獼猴桃很難獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)，采用人工輔助授粉顯得尤為必要，研究表明人工授粉的坐果率明顯高于自然授粉。

▲獼猴桃電動(dòng)授粉槍授粉

江西省奉新縣是江西最早開(kāi)始種植獼猴桃的集中區(qū)域，在長(zhǎng)期的生產(chǎn)栽培過(guò)程中，不斷發(fā)掘當(dāng)?shù)匾吧J猴桃雄株的同時(shí)也不斷引進(jìn)外來(lái)雄株進(jìn)行授粉，因此該地區(qū)雄株品種豐富，存在著同物異名、同名異物等現(xiàn)象。并且各雄株花粉性狀表現(xiàn)參差不齊，對(duì)人工制粉、授粉造成嚴(yán)重的干擾，急需對(duì)當(dāng)?shù)?span id="84ivanw" class='wp_keywordlink'>獼猴桃授粉雄株進(jìn)行分子鑒定和分類(lèi)以及篩選出花粉量大、花粉活力高的配套雄株，以達(dá)到獼猴桃高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的目的。據(jù)此，本試驗(yàn)擬以項(xiàng)目組前期收集的 48 份獼猴桃雄株為試驗(yàn)材料，測(cè)定其倍性、花藥數(shù)、花粉量、花粉活力并進(jìn)行聚類(lèi)和相關(guān)性分析研究，探究其花粉特性，以期為篩選不同花期的優(yōu)良配套授粉雄株提供理論依據(jù)和材料基礎(chǔ)。

▲江西奉新獼猴桃

1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
以項(xiàng)目組前期收集的來(lái)源于中華獼猴桃和美味獼猴桃的 48 份雄株為試驗(yàn)材料，參照楊紅等的方法，每份材料各采集 1～3 片幼葉和大蕾期花苞 20 朵，放于自封袋中并做好標(biāo)記，迅速放入冰盒并運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室處理。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 雄株倍性測(cè)定
取約0.5cm2樣品幼葉放于平面載玻片上，加入400μL 萃取液，使用尖銳的刀片用力橫切樣品，并浸泡2～5 min，之后將樣品以及液體用過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾到樣品管中，再加入1600μL的DAPI 染液，避光染色2～5min 后，利用 CyFlow Cube 流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性檢測(cè)。在測(cè)定樣品前，先以已知倍性的‘紅陽(yáng)’（2x）及‘金艷’（4x）為標(biāo)樣，設(shè)定好電壓、流速等相關(guān)指標(biāo)后開(kāi)始測(cè)定樣品倍性。

▲獼猴桃雄花

1.2.2 花藥數(shù)量的記錄
隨機(jī)選取10個(gè)大蕾期花苞，用鑷子將其花藥剝離于A(yíng)4 紙上，清點(diǎn)其花藥數(shù)量并記錄。

1.2.3 花粉量的測(cè)定
參照沈根華等的方法，隨機(jī)選取50?；ㄋ幱?mL離心管中，重復(fù)3次，置于28 ℃恒溫箱中24h使其花粉完全散開(kāi)，加入200g/L六偏磷酸鈉2mL，在旋渦振蕩儀上振蕩成懸浮液，選取400μL于2mL離心管中，再加入1600 μL 六偏磷酸鈉，搖勻，使用血小球計(jì)數(shù)板，置于顯微鏡下觀(guān)察并統(tǒng)計(jì)其花粉粒數(shù)。

▲江西奉新獼猴桃

1.2.4 花粉活力的測(cè)定
使用體外萌發(fā)法，參照齊秀娟等[8]方法并改良，最適固體培養(yǎng)基為10%蔗糖+100mg/L 硼酸+10mg/L 硝酸鈣+0.8%瓊脂粉。將所有的花藥剝離后，包在A(yíng)4紙中，置于28 ℃恒溫箱中烘24h，使花粉自然散出。用毛筆蘸取少量烘制好的花粉，均勻撒在滴有培養(yǎng)基的載玻片上，并置于鋪好濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，在28 ℃下培養(yǎng)3.5h后用顯微鏡觀(guān)察，統(tǒng)計(jì)其萌發(fā)率?；ǚ凼欠衩劝l(fā)以花粉管長(zhǎng)度超過(guò)花粉粒直徑作為依據(jù)，每份材料做3組載玻片，每載玻片選取2個(gè)視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，每個(gè)視野花粉粒數(shù)為50～80粒。
1.2.5 數(shù)據(jù)處理
利用 SPSS Statistics17.0 軟件對(duì)雄株倍性、花藥數(shù)、花粉量、花粉活力進(jìn)行相關(guān)性分析。使用NTSYSpc 2.10e 軟件進(jìn)行不同雄株花藥數(shù)、花粉量、花粉活力的聚類(lèi)分析。

▲獼猴桃雄株倍性差異與花粉性狀的相關(guān)性分析

2 結(jié)果與分析
2.1 不同雄株倍性、花藥數(shù)、花粉量、花粉活力分析
如表 1 所示，供試的 48 份雄株倍性有 2x、4x、6x 3 種類(lèi)型，其中，中華獼猴桃多為低倍性（2x、4x），2x 占整個(gè)供試中華獼猴桃樣品總數(shù)的 72.09%，變異系數(shù)為 35.48%，美味獼猴桃均為 6x；每朵花花藥數(shù)為 30～193 粒，47號(hào)雄株最多，38 號(hào)雄株最少；每花藥花粉量為 1 000～23 000 個(gè)，22 號(hào)雄株最多，4、10、13、43 號(hào)雄株最少；花粉活力為11.06%～81.40%，43號(hào)雄株最高，29號(hào)雄株最低。
其中，中華獼猴桃雄株每朵花花藥數(shù)為30～90粒，平均為55粒；每花藥花粉量為1000～23000 粒，平均 7884粒；花粉活力為 11.06%～81.40%，平均花粉活力為 51.62%，變化幅度均較大。美味獼猴桃雄株每朵花花藥數(shù)為142～193粒，平均為163粒；每花藥花粉量為3000～5000 粒，平均為 4 000 粒；花粉活力為 32.67%～53.17%，平均為46.31%，變化幅度均較小。由此可見(jiàn)，美味獼猴桃的花藥數(shù)整體上高于中華獼猴桃，但花粉量和花粉活力整體上低于中華獼猴桃。

▲國(guó)內(nèi)培育的優(yōu)質(zhì)獼猴桃雄花

2.2 不同雄株的倍性、花藥數(shù)、花粉活力相關(guān)性分析
利用 SPSS Statistics17.0 軟件對(duì)不同雄株的倍性、花藥數(shù)、花粉活力進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，倍性與花藥數(shù)呈極顯著正相關(guān)，皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.811，其他指標(biāo)間相關(guān)性均不顯著（表 2）。
對(duì)不同雄株的倍性、花藥數(shù)、花粉量、花粉活力進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果如圖1所示，以遺傳相似系數(shù) 1 803.16 為界，將 48 份樣品分成 4 大類(lèi)。其中Ⅰ類(lèi)群有12個(gè)單株，其花粉量變化幅度最大，每花藥花粉量集中在 6 000～8 000 粒；Ⅱ類(lèi)群有 20個(gè)單株，其平均花藥數(shù)最多且變化幅度最大，最大花藥數(shù)與最小花藥數(shù)樣品均在此類(lèi)群中，同時(shí)該類(lèi)群包含了 2x、4x、6x ３種類(lèi)型倍性植株；Ⅲ類(lèi)群有13 個(gè)單株，平均花粉活力最高；Ⅳ類(lèi)群有 3 個(gè)單株，平均花粉量最高且均為2x倍性，花藥數(shù)與花粉活力變化幅度最小。結(jié)合 4大類(lèi)群的聚類(lèi)特征可篩選出7份花粉活力大于60%、每朵花花藥數(shù)多于50粒、每花藥花粉量大于6000 粒的單株，即 18、19、22、31、34、40、42 號(hào)雄株。

▲獼猴桃雄株倍性差異與花粉性狀的相關(guān)性分析

由表3可知，花藥數(shù)、花粉量以及花粉活力在4大類(lèi)群中的變異系數(shù)變化幅度均較大，這表明獼猴桃花藥數(shù)、花粉量及花粉活力具有遺傳多樣性。其中，II 類(lèi)群的花藥數(shù)、花粉量及花粉活力離散程度高于其他 3 個(gè)類(lèi)群，說(shuō)明花藥數(shù)、花粉量及花粉活力在 II 類(lèi)群中具有豐富的遺傳多樣性。美味獼猴桃雄株花藥數(shù)、花粉量、花粉活力的變異系數(shù)均低于中華獼猴桃雄株。

▲獼猴桃雄株倍性差異與花粉性狀的相關(guān)性分析

3 結(jié)論與討論
獼猴桃花期較短，如遇低溫多雨，不僅會(huì)影響花粉的正常發(fā)育，還會(huì)抑制花粉的傳播，進(jìn)而影響坐果率和產(chǎn)量，所以常需要進(jìn)行人工授粉來(lái)提高坐果率。人工授粉的關(guān)鍵在于花粉本身與授粉方式，不同的授粉方式對(duì)坐果率有決定性的影響。
不同倍性的雄株對(duì)獼猴桃的坐果狀況及果實(shí)單果重、果肉顏色、種子千粒重等性狀具有顯著影響。曾華等研究發(fā)現(xiàn)，中華獼猴桃存在 2x 和 4x 2種倍性水平，美味獼猴桃存在 4x、5x、6x 3 種倍性水平。本研究結(jié)果表明，供試的中華獼猴桃多為低倍性（2x、4x），2x倍性的雄株居多，美味獼猴桃則均為6x，并沒(méi)有 4x、5x 倍性水平的樣品，這與采集樣品具有直接關(guān)系。在供試樣品中，中華獼猴桃雄株倍性變異系數(shù)為 35.48%，可見(jiàn)中華獼猴桃的倍性水平具有較高的遺傳多樣性。

▲獼猴桃雄株倍性差異與花粉性狀的相關(guān)性分析

供試的48份獼猴桃雄株每朵花花藥數(shù)最多為193粒，最少為30粒，由此可見(jiàn)在同一種內(nèi)不同品種間差異較大，在小麥上的研究發(fā)現(xiàn)不同基因型小麥花藥培養(yǎng)特性差異也較大。葉正文等研究表明，每花藥花粉量與品種特性、樹(shù)體營(yíng)養(yǎng)以及當(dāng)年氣候條件、栽培管理措施等外界條件有關(guān)，但與品種的關(guān)系最為密切。吳振玲等研究表明，春季前期積溫的高低對(duì)花粉量有決定性的影響。本研究結(jié)果表明，48份獼猴桃雄株每朵花花粉量最高的為23000粒，最低為1000粒，差異也較大?？紤]到獼猴桃新鮮花粉活力最高和環(huán)境對(duì)花粉活力的影響，本試驗(yàn)全采用新鮮花粉進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示48份不同雄株中花粉活力最高為81.40%，最低為11.09%，參照沈根華等活力低于30%不宜選作授粉雄株，供試樣品中花粉活力低于30%的達(dá)16.67%。總體來(lái)看，花藥數(shù)、花粉量、花粉活力在同一種內(nèi)不同品種間存在較大的差異性，其中中華獼猴桃雄株花粉量和花粉活力整體上高于美味獼猴桃，花藥數(shù)則整體低于美味獼猴桃雄株，該結(jié)果與齊秀娟等研究結(jié)果基本一致。同時(shí)在桃、棗、蘋(píng)果、山楂、梨、杏上的研究也表明，同一物種但不同品種間花粉量以及花粉活力差異較大。

▲貴州獼猴桃花粉

▲遵義市播宏獼猴桃果園有限公司是西南地區(qū)最大的獼猴桃果業(yè)公司，種植1200畝高山獼猴桃，是遵義市農(nóng)業(yè)龍頭企業(yè)，市級(jí)先進(jìn)扶貧企業(yè)。其中獼猴桃花粉項(xiàng)目是中國(guó)單體面積最大的獼猴桃花粉園，單體采粉園達(dá)到了400畝，豐產(chǎn)期產(chǎn)花粉400公斤，提供高品質(zhì)、高倍體、高活性的獼猴桃花粉，可以滿(mǎn)足30000畝果園的花粉需要。聯(lián)系微信18030405084