獼猴桃花粉原位生長過程中Ca2+的超微細胞化學定位
齊秀娟1，2，張紹鈴1*，方金豹2
（1南京農(nóng)業(yè)大學梨工程技術(shù)研究中心，南京 210095；2中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所，果樹生長發(fā)育與品質(zhì)控制重點開放實驗室 鄭州 450009）
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摘要：應(yīng)用掃描電鏡和熒光顯微鏡對軟棗獼猴桃同種花粉在柱頭上原位萌發(fā)及花粉管生長情況進行了觀察，并用焦銻酸鹽沉淀法對其授粉前后柱頭及花柱中Ca2+進行超微細胞化學定位，研究結(jié)果表明：（1）獼猴桃柱頭屬于干性柱頭，具有一道裂溝, 乳突呈長圓柱形，授粉前后形態(tài)差異不明顯；（2）授粉后3h，花粉管生長穿過柱頭表面，授粉后7h，生長到達花柱底部；（3）授粉前后，柱頭接受面靠近柱頭外圍細胞的角質(zhì)層一側(cè)細胞器內(nèi)含有豐富的鈣，而柱頭非接受表面鈣顆粒分布很少；（4）授粉前和授粉后3h，花柱頂端鈣顆粒較少，基部鈣顆粒較多；授粉后7h，花柱頂端和基部鈣分布密度無明顯差別；（5）授粉前后花柱頂端鈣主要均勻分布在細胞質(zhì)膜位置；在花柱基部授粉前主要在引導組織胞間隙中，授粉后3h主要在細胞質(zhì)內(nèi)，授粉后7h主要存在于細胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。獼猴桃授粉前后，柱頭和花柱組織中均含有鈣，授粉前和授粉后3h花柱中的鈣呈現(xiàn)出梯度分布，授粉后7h鈣的梯度分布現(xiàn)象減弱甚至消失。
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關(guān)鍵詞：軟棗獼猴桃；柱頭；花柱；鈣
Ultracytochemical Localization of Calcium in Pollen Situ Growth of Kiwifruit
QI Xiu-juan1，2，ZHANG Shao-ling1*,FANG Jin-bao2
(1 Pear Engineering Research Centre,Nanjing Agriculture University,Nanjing,Jiangsu 210095,Chin, China;；2Key Laboratory for Fruit Tree Growth, Development and Quality Control, Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450009，China)
（獼猴桃花粉采摘）
Abstract: Fluorescence microscope and scanning electron microscopy were used to observe pollen germination and pollen tube growth, Potassiam antimonate was used to localize calcium in stigma and style tissue of A.argutar before and after pollination.（1）Stigma of A.argutar was dry, it was long cylindrical Shape and had a crack ditch, the form difference was not obvious before and after pollination. （2）3h after pollination , pollen tube grew through stigma surface, and got to basal style 7h after pollination （3）Receptive surface of stigma, Cuticle organelles were rich in calcium granules before and after pollination, but no-receptive surface of stigma, organelles had little calcium granules.（4）Top style had little calcium, but basal style had more calcium before and 3h after pollination. The calcium contents were briefly identical in top and basal style 7h after pollination. （5）The calcium distributed in plasma membrane of top style before and after pollination, in intercellular gap of basal style before pollination, in plasma membrane of basal style 3h after pollination, and in plasma membrane and endoplasmic reticulum of basal style 7h after pollination. Stigma and style tissue of A.argutar were rich in calcium before and after pollination. Calcium of style showed the gradient distribution before and 3h after pollination, it weakened or disappeared 7h after pollination.
Keywords： A.argutar； stigma； style； caleium
鈣是植物體內(nèi)重要的第二信使，其在植物體內(nèi)的分布及濃度變化，調(diào)節(jié)著許多代謝和發(fā)育過程[1]。鈣在花粉萌發(fā)和花粉管向性生長中的重要作用已在多種植物的離體花粉培養(yǎng)實驗中證實[2-4]。研究表明，離體生長的花粉管需要不斷的從外界吸收Ca2+以維持花粉管頂端的游離Ca2+梯度分布，為其極性生長創(chuàng)造條件，同時生長的花粉管需要源源不斷的將Ca2+補充到新形成的花粉管的果膠層中以增強花粉管壁的硬度[5]。迄今為止，雖然植物有性生殖中Ca2+功能的研究已經(jīng)取得了重大進展，但是還有很多問題尚需要解決。有關(guān)Ca2+調(diào)節(jié)花粉管生長的結(jié)果大多是在離體條件下獲得的，花粉管在離體和體內(nèi)生長的環(huán)境條件不盡相同，盡管離體生長系統(tǒng)可以模擬但不能完全代替花粉管的體內(nèi)生長狀況，所以要了解受精過程雌蕊組織中Ca2+與花粉管生長的關(guān)系，還需研究花粉管生長途徑的雌蕊組織中Ca2+分布狀況。
▲陽光金果獼猴桃花粉
與離體花粉萌發(fā)和花粉管生長過程中Ca2+作用機理的研究相比，對體內(nèi)雌蕊組織中的Ca2+與花粉萌發(fā)和花粉管生長的關(guān)系則研究相對較少，尤其是雌蕊的柱頭和花柱組織中Ca2+分布的研究更少[5]。近20年來用焦銻酸鉀方法雖然已對多種植物的柱頭和花柱組織進行了觀察，并發(fā)現(xiàn)柱頭和花柱引導組織中分布有豐富的Ca2+，但是柱頭、花柱組織中是否存在一個引導花粉管生長的Ca2+分布梯度問題至今尚無定論，需要廣泛采用多種植物進行研究。就研究對象而言，果樹作物有關(guān)雌蕊體內(nèi)Ca2+分布的研究還屬空白。本研究利用熒光顯微鏡及掃描電鏡觀察獼猴桃花粉原位萌發(fā)及花粉管生長的基礎(chǔ)上，結(jié)合利用焦銻酸鉀沉淀法研究獼猴桃授粉前后柱頭與花柱中的Ca2+分布變化，旨在揭示獼猴桃樹種花粉管原位生長過程中柱頭與花柱組織中Ca2+的分布問題。
1 材料與方法
1.1材料
試驗于2010年5月采用中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所獼猴桃資源圃（113°71′E， 34°71′N）內(nèi)的軟棗獼猴桃（A. argutar）品種‘天源紅’進行，該品種在鄭州地區(qū)花期為5月6日～11日。在大蕾期用中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所果袋公司生產(chǎn)的石榴專用羊皮紙袋進行單花套袋，在開花當天上午9時用事先準備好的同種獼猴桃花粉進行人工點授，授完粉后再立即重新套袋。
1.2方法
1.2.1花部特征觀察
在初花期上午9時左右選擇樹體中部、樹冠外圍的典型花朵，肉眼觀察花的結(jié)構(gòu)特征。
1.2.2熒光顯微鏡觀察
在授粉前、授粉后3h和7h，分別采集花朵用冰壺帶回實驗室，立即用刀片從花柱基部（子房與花柱連接處）切取花柱（含柱頭），F(xiàn)AA固定液固定?；ㄖ膲浩瑓⒄誎ho等[6]的方法，從固定液中取出花柱，用蒸餾水沖洗2遍，用2mol×L-1的NaOH放置在65℃的恒溫箱中軟化處理3h，然后用0.1mol×L-1K3PO4溶液配制的0.1%的苯胺蘭染色液染色3h。染色后的花柱做成壓片，用日本OLYMPUS BX51型熒光顯微鏡觀察花粉萌發(fā)和花粉管的生長情況，各處理分別觀察5朵花的10根花柱，選取典型圖片拍照。
1.2.3掃描電鏡觀察
取授粉前和授粉后3h的柱頭樣品用2.5%戊二醛和1%鋨酸雙固定，經(jīng)0.1 mol×L-1磷酸緩沖液（pH7.8）沖洗、丙酮梯度脫水、醋酸異戊酯置換、臨界點干燥、粘樣和噴金后, 置于XL30ESEM環(huán)境掃描電鏡下，觀察柱頭表面結(jié)構(gòu)及花粉與柱頭的附著狀態(tài)并拍照。各處理分別觀察5朵花的10根花柱柱頭，選取典型圖片拍照。
▲生產(chǎn)線上拿下來的播宏獼猴桃花粉，一瓶就是一公斤
1.2.4 Ca2+超微細胞化學定位
采用焦銻酸鉀沉淀法進行Ca2+的超微細胞化學定位。在授粉前、授粉后3h和7h分別選擇5朵花，用單面刀片切取柱頭、花柱頂端（柱頭下1mm處）和花柱基部（子房上1mm處）1mm左右，將樣品迅速投入到含2.5％戊二醛和2％焦銻酸鉀的0.1 mol× L-1磷酸緩沖溶液（pH7.8）配制的前固定液中室溫下抽氣并固定3h，然后用含2％焦銻酸鉀、0.1 mol× L-1磷酸緩沖溶液（pH7.8）配置的洗滌液清洗3次，每次30min，再將材料轉(zhuǎn)入0.1mol× L-1磷酸緩沖溶液配制的含1％鋨酸、2％焦銻酸鉀的后固定液中在4℃下固定16h左右，用相同的洗滌液清洗3次，每次30min。系列梯度丙酮脫水，Epon812樹脂包埋。包埋的柱頭和花柱材料用超薄切片機切片，切片厚度為70nm，切片不進行染色，用日立Hitach-6050型透射電子顯微鏡觀察和拍照。
2結(jié)果與分析
2.1‘天源紅’的花部特征
‘天源紅’為軟棗獼猴桃雌性品種，單花或二歧聚傘花序，每花序有花1～3朵，輻狀花冠，冠徑約15～18mm；花萼5～6片，偶有4片，綠略帶紅色，卵形；花瓣白色，略有片狀紅暈，近圓形，基部相接，邊緣無波皺，中間有一淺裂；雄蕊多數(shù)，花藥黃黑色，花粉?？瞻T，花絲退化或極短；單花花柱21～23個，長度（0.42±0.25）cm，白色，斜生或水平；子房上位，瓶狀，綠色，縱徑長（2.68±0.18）mm，無毛。（圖版Ⅰ，1）。
▲紅心獼猴桃花粉
2.2花粉粒在柱頭表面的萌發(fā)和花粉管生長路徑
通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，‘天源紅’授粉后3h，很多柱頭上花粉粒大量萌發(fā)，多數(shù)花粉管已經(jīng)穿過柱頭表面，進入柱頭內(nèi)部（圖版Ⅰ，2）。授粉后7h，很多花粉管已生長到花柱底部（圖版Ⅰ，3）。通過掃描電鏡觀察柱頭具有一道裂溝(圖版Ⅰ，4)，表面有大量乳突細胞分布，無黏液分泌，乳突呈長圓柱形，頂端呈鈍圓、尖凸或凹陷三種形態(tài)(圖版Ⅰ，5)。比較授粉前(圖版Ⅰ，5)和人工授粉后3h (圖版Ⅰ，6)的柱頭， 二者形態(tài)差異不明顯，僅個別乳突細胞表面紋理增多、凹陷變深。無論在光鏡下還是在電鏡下都可以觀察到萌發(fā)后的花粉管從乳突細胞的間隙進入柱頭的內(nèi)部(圖版Ⅰ，2和圖版Ⅰ，6)。
▲陽光金果獼猴桃花粉
2.3授粉前后Ca2+分布的變化
2.3.1授粉前后柱頭Ca2+的分布變化
‘天源紅’柱頭為干性柱頭，柱頭的乳突細胞下面為花柱引導組織。乳突細胞相對的內(nèi)表面為花粉接受面，外表面為非接受面。在未授粉的大蕾期，靠柱頭外圍角質(zhì)層一側(cè)細胞壁、細胞質(zhì)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡等細胞器里均含有許多Ca2+顆粒（圖版Ⅰ，7），而在柱頭非接受面表皮細胞壁中Ca2+幾乎沒有分布（圖版Ⅰ，8），這種Ca2+分布狀態(tài)與離體花粉萌發(fā)和花粉管生長時需要胞外Ca2+的試驗結(jié)果相一致。
▲十克裝的播宏獼猴桃花粉
授粉后3h，柱頭細胞壁外圍、細胞質(zhì)里有一些Ca2+顆粒沉淀（圖版Ⅰ，9）。授粉后7h柱頭細胞外表的細胞壁靠角質(zhì)層一側(cè)和液泡里仍分布有豐富的Ca2+顆粒（圖版Ⅰ，10），隨著柱頭上附著的花粉萌發(fā)、花粉管的生長，花粉粒的萌發(fā)孔處的細胞壁中也出現(xiàn)很多Ca2+沉淀顆粒（圖版Ⅰ，11），這些Ca2+沉淀可能與形成花粉管極性有關(guān)[7]。隨著花粉管穿過柱頭細胞向花柱引導組織中生長，在花粉管頂端壁中出現(xiàn)大量非常細小的Ca2+顆粒（圖版Ⅰ，12），推測這些Ca2+沉淀可能與花粉管的轉(zhuǎn)向生長有關(guān)[8-10]。柱頭細胞質(zhì)內(nèi)還可見較大黑色顆粒（圖版Ⅰ，13）推測可能是細胞質(zhì)降解時產(chǎn)生的濃縮。同時，柱頭非接受面授粉后Ca2+顆粒分布仍然很少（圖版Ⅰ，14）。
（本文配圖為貴州省遵義市播州區(qū)播宏果業(yè)有機獼猴桃施肥照片）
2.3.2授粉前后花柱的Ca2+分布變化
獼猴桃花柱為閉合型，中央為引導組織，四周是具有較大細胞間隙的薄壁細胞組織。其中，引導組織是花粉管生長的通道，其胞間隙較發(fā)達。
未授粉前，花柱頂部Ca2+沉淀較少，主要均勻分布在細胞質(zhì)中貼近質(zhì)膜的位置，且顆粒相對較大，在引導組織胞間隙的中央、薄壁組織以及細胞壁中幾乎沒有Ca2+沉淀（圖版Ⅰ，15）；基部Ca2+數(shù)量較多，主要分布在引導組織胞間隙中，而且顆粒較大（圖版Ⅰ，16），同時在細胞質(zhì)膜和細胞壁內(nèi)壁上也有少量較大顆粒的Ca2+沉淀。說明在授粉前花柱的頂端和基部組織已經(jīng)出現(xiàn)了一個Ca2+梯度。
授粉后3h花柱頂端Ca2+的分布位置和沉淀量未見明顯變化；在花柱基部，Ca2+大量沉積在細胞質(zhì)內(nèi)，而胞間隙未見存在（圖版Ⅰ，17）。上述結(jié)果顯示，授粉后3h，由于花粉管生長剛剛穿過柱頭乳突細胞，花柱頂端的Ca2+相對較少而花柱基部的Ca2+相比較很多，Ca2+的梯度分布特征仍然保持。
授粉后7 h花柱頂端引導組織的橫切面上（圖版Ⅰ，18）可看到花粉管壁最外層, 即果膠質(zhì)層及靠近管壁的胞間基質(zhì)中，有少量的Ca2+沉淀；引導組織細胞壁內(nèi)膜上積累了大量細小的Ca2+顆粒，在胞間隙里卻未見分布（圖版Ⅰ，19）。在花柱基部Ca2+顆粒主要分布在細胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等部位，而在引導組織胞間隙、細胞壁內(nèi)膜等部位沒有Ca2+分布（圖版Ⅰ，20）。透射電鏡觀察授粉后7h花柱頂部和基部的Ca2+沉淀量大致相同，說明當花粉管已生長到花柱底部進入子房以后，Ca2+分布位置明顯變化，而且花柱中Ca2+梯度作用會減弱甚至消失。
3 討論
3.1柱頭表面內(nèi)Ca2+的分布及其作用
很多種類的植物在接受花粉的柱頭上都會積累大量的Ca2+，例如金魚草[11]、番薯[12]、假葉樹[13]、油菜[14]、向日葵[15]、棉花[16]、水稻[17]、甘藍[18]、煙草[19]、萵苣 [20]等，這些Ca2+多分布于細胞壁和胞間基質(zhì)等質(zhì)外體系統(tǒng)中，均與其柱頭上花粉的萌發(fā)有關(guān)。在本研究中，獼猴桃未授粉的柱頭上，靠柱頭外圍角質(zhì)層一側(cè)細胞壁、細胞質(zhì)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器里均含有許多Ca2+顆粒；授粉后3h，柱頭細胞壁外圍、細胞質(zhì)里仍有一些Ca2+顆粒沉淀；授粉后7h柱頭細胞外表的細胞壁靠角質(zhì)層一側(cè)和液泡里仍分布有豐富的Ca2+顆粒。這些豐富的Ca2+顆粒也與其柱頭表面的花粉萌發(fā)有關(guān)。上述結(jié)果與很多植物花粉離體萌發(fā)實驗中需一定Ca2+的原因相一致，表明離體花粉萌發(fā)和花粉管伸長需要從培養(yǎng)基中吸收胞外Ca2+的過程在體內(nèi)由柱頭表皮細胞提供，離體和體內(nèi)試驗結(jié)果相一致。
3.2花柱內(nèi)是否存在Ca2+分布梯度
花柱內(nèi)Ca2+是否具有梯度分布在不同植物上的研究結(jié)果不盡一致。在油菜{14]，向日葵[15] 、陸地棉[16] 和水稻[17]等植物中沒有發(fā)現(xiàn)Ca2+的梯度分布現(xiàn)象。在金魚草[11]雌蕊組織中的研究表明存在著從柱頭到胚珠Ca2+增加的梯度。煙草[19]中Ca2+沉淀顆粒呈梯度分布，越接近子房，引導組織之間的細胞壁中的Ca2+顆粒越多。在萵苣[20]中，授粉前花柱中的Ca2+雖不多，但從花柱頂端至基部的引導組織和其外圍的薄壁組織中已呈現(xiàn)出了明顯的Ca2+顆粒遞增的梯度分布特征。本研究認為獼猴桃花柱頂端和基部在授粉前和花粉管剛剛穿過柱頭生長沒有到達柱頭底部前存在Ca2+分布梯度，而在花粉管穿過花柱基部以后這種Ca2+梯度就會減弱或消失。分析不同植物Ca2+分布梯度存在與否的原因，有研究認為的向日葵、陸地棉、水稻不存在Ca2+梯度可能與該三種植物花柱很短，授粉到受精的時間為數(shù)小時到十余小時，花柱中無需Ca2+的梯度分布定向吸引[19]的結(jié)論似乎與本研究結(jié)果相矛盾，‘天源紅’花柱只有4mm左右，而且在授粉后7h，花粉管生長就已經(jīng)到達花柱底部進入子房，在花粉管沒有到達花柱底部前，Ca2+梯度依舊存在，定向吸引花粉管生長，而花粉管完全進入子房開始生長以后，花柱中的這種Ca2+梯度作用就會減弱或者消失。所以，不同植物花柱中Ca2+梯度分布的差異有可能與植物的種類和檢測時間有關(guān)。至于獼猴桃子房中的胚囊各部位與花柱間是否存在Ca2+梯度問題需要進一步開展研究方能確定。
（播宏公司在貴州遵義的獼猴桃基地，小面積采用了機械授粉，效果不錯）
獼猴桃花粉
獼猴桃花粉授粉
獼猴桃花粉檢測
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