摘 要：系統(tǒng)調(diào)查了中國陜西省獼猴桃主產(chǎn)區(qū)周至、眉縣、楊凌和漢中‘徐香’、‘海沃德’、‘華優(yōu)’和‘秦美’獼猴桃上獼猴桃病毒 A（AcVA）和獼猴桃病毒 B（AcVB）的帶毒率和分布情況。結(jié)果表明，AcVA 和 AcVB 在 4 個產(chǎn)區(qū)均有廣泛地分布和較高的帶毒率。其中，AcVA 和 AcVB 分別在楊凌（36.7%）和眉縣（36.9%）有最高的帶毒率。按照品種劃分，AcVA（32.3%）和 AcVB（32.9%）均在‘徐香’品種上有最高的帶毒率。通過高通量測序與分析獲得了 AcVA 和 AcVB 的基因組序列，其分別由 7 654 和7 454 個核苷酸組成，與之前報道的TP7-93A 和 TP7-93B 分離物對應(yīng)的同源率分別為82.7%和 78.5%。AcVA和 AcVB 外殼蛋白基因系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，2 種病毒分成 2 個組，存在較大的分子變異。
中國的獼猴桃種植面積和產(chǎn)量均位居世界第一（Belrose，2016）。陜西省是中國最大的獼猴桃生產(chǎn)省份，截止 2017 年，陜西省的獼猴桃種植面積已超過 6.7 萬 hm2，產(chǎn)量超過 130 萬 t。陜西省的獼猴桃種植區(qū)域主要集中在周至、眉縣、武功、楊凌、漢中等地，種植品種主要有‘徐香’、‘海沃德’、‘秦美’、‘華優(yōu)’、‘翠香’、‘紅陽’、‘秦紫 1 號’和‘秦紫光 1 號’等（吳永朋 等，2019；張瑩 等，2020）。
▲獼猴桃苗
近年來，全世界不斷有獼猴桃病毒病害的報道，在這些報道的病毒中，一部分是獼猴桃上發(fā)現(xiàn)的新病毒，另一部分是已知的以獼猴桃為新寄主的病毒（Blouin et al.，2013；Chavan et al.，2013；Zheng et al.，2017）。目前為止，已報道可侵染獼猴桃的病毒主要有獼猴桃病毒 A（Actinidia virus A，AcVA）、獼猴桃病毒 B（Actinidia virus B，AcVB）、獼猴桃病毒 1（Actinidia virus 1，AcV-1）、獼猴桃褪綠環(huán)斑相關(guān)病毒（Actinidia chlorotic ringspot-associated virus，AcCRaV）和黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）等（Pearson et al.，2011；Blouin et al.，2012，2013；Wang et al.，2016；彭期定 等，2020）。
前期調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)陜西省 AcVA、AcVB、AcCRaV 和 CMV 等病毒是侵染‘徐香’獼猴桃的主要病毒（Zhao et al.，2019）。其中 AcVA 和 AcVB 是 2012 年首次在新西蘭獼猴桃上發(fā)現(xiàn)的病毒（Blouin et al.，2012）。目前關(guān)于這兩種病毒的基因組，分別只有來自新西蘭的一條全基因組的報道（Blouin et al.，2012）。這兩種病毒在中國陜西省獼猴桃主產(chǎn)區(qū)海沃德、華優(yōu)和秦美獼猴桃品種上的帶毒率、分子變異一直未有相關(guān)的研究報道。
本研究中系統(tǒng)調(diào)查了陜西周至、眉縣、楊凌和漢中的徐香、海沃德、華優(yōu)和秦美獼猴桃上 AcVA和 AcVB 的帶毒率，測定了這 4 個主產(chǎn)區(qū) 2 種病毒的多個全長外殼蛋白基因序列，分別分析了它們的分子變異情況；這兩個病毒中國分離物的基因組也一直未有相關(guān)的研究報道，本研究中通過高通量測序和分析，分別獲得了 AcVA 和 AcVB 中國陜西周至分離物的基因組序列。
▲紅心獼猴桃果園
1 材料與方法
1.1 材料
分別于 2018 年和 2019 年的 4—5 月，在陜西周至、眉縣、楊凌和漢中隨機采集表現(xiàn)疑似病毒病癥狀的‘徐香’、‘海沃德’、‘華優(yōu)’和‘秦美’獼猴桃葉片。共采集了 126 個獼猴桃園的 458 份樣品，每個果園采集 3 ~ 5 份樣品。所有樣品保存于–80 ℃?zhèn)溆谩?/p>
1.2 病毒的 RT-PCR 檢測
參照 TRIzol 試劑盒說明書的方法提取獼猴桃葉片樣品的總 RNA。用微量紫外分光光度計測定RNA 濃度后，取 1 μg 總 RNA 用隨機引物和 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA（Zhao et al.，2012）。分別用 Blouin 等（2012）和 Zheng 等（2017）報道的引物序列檢測 AcVA 和 AcVB。擴增 AcVA 和AcVB 全長外殼蛋白基因的引物根據(jù)已報道的 AcVA 和 AcVB 的全基因組設(shè)計。引物序列為AcVACPF：TGCCTAGCGTGTATGAAGC；AcVACPR：CCGTGAGAAATGATGGGTC；AcVBCPF：CTTCCCTGGTTACTTTGTG；AcVBCPR：GTTTATTCACGCCTGTCTC。所有引物均用如下 PCR程序：94 ℃變性 3 min，94 ℃變性 30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，35 次循環(huán)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測和測序確定有無目標病毒。
▲獼猴桃花粉廠家
1.3 克隆、序列測定與分析
PCR 產(chǎn)物經(jīng) DNA 回收試劑盒純化后，連接到 pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化 JM109 大腸桿菌。PCR 檢測陽性克隆送北京奧科鼎盛生物科技有限公司進行測序，每個樣品送 3 個克隆。用 CLUSTAL X（Thompson et al.，1997）軟件對本研究中所測定的以及 GenBank 中已有的 AcVA 和 AcVB 的全長外殼蛋白基因序列進行比對。然后用MEGAv.7.0軟件，使用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Tamura et al.，2011）。
1.4 轉(zhuǎn)錄組測序與分析
取 1 個采集自陜西周至，經(jīng) RT-PCR 檢測確定同時被 AcVA 和 AcVB 侵染的海沃德獼猴桃樣品，送武漢華大基因科技有限公司進行 RNA 的提取，去 rRNA 建庫，用 Illumina HiSeq X-ten 平臺進行測序。測序完成后用 CLC Genomics Workbench 9.5 軟件進行分析，去除接頭和低質(zhì)量的序列后與GenBank 中已報道的獼猴桃的基因組進行匹配分析。用 Trinity program（Haas et al.，2013）軟件對沒有匹配的序列進行組裝，獲得大片段。在 NCBI 數(shù)據(jù)庫對所獲得的大片段進行 BLAST，分別找到與 AcVA 和 AcVB 同源的序列。
▲獼猴桃采收
2 結(jié)果與分析
2.1 AcVA 和 AcVB 的帶毒率
在許多表現(xiàn)褪綠和畸形的葉片樣品中可檢測到 AcVA 和 AcVB（圖 1）。AcVA 和 AcVB 在陜西周至、眉縣、楊凌和漢中等不同主產(chǎn)區(qū)的獼猴桃樣品中帶毒率不同（表 1），它們分別在楊凌（36.7%）和眉縣（36.9%）的帶毒率最高。AcVA 和 AcVB 帶毒率最低的主產(chǎn)區(qū)均為漢中，分別為 16.9%和15.5%。AcVA 和 AcVB 在陜西不同獼猴桃栽培品種上的帶毒率不同（表 2），均在徐香品種上有最高的帶毒率，分別為 32.3%和 32.9%。AcVA和 AcVB 帶毒率最低的品種分別為‘秦美’（23.6%）和‘華優(yōu)’（23.7%）。
2.2 轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果
獼猴桃樣品經(jīng)過轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了 67 048 288 條序列。經(jīng)過去除接頭和低質(zhì)量序列后與獼猴桃基因組進行匹配，獲得了 2 876 725 條（4.29%）未匹配的序列。經(jīng)過組裝，獲得了 7 133 條片段。片段的長度為 200 ~ 18 860 nt。經(jīng)過 BlastN 和 BlastX，獲得了 2 條序列分別與 AcVA 和 AcVB 匹配，為 AcVA 和 AcVB 陜西周至分離物的基因組序列。同時還獲得了多條序列分別與 AcCRaV 和 CMV匹配。證明該樣品中含有 AcVA、AcVB、AcCRaV 和 CMV。
▲紅心獼猴桃圖片
2.3 AcVA 和 AcVB 的基因組分析
本研究所獲得的 AcVA 和 AcVB 的分離物分別命名為 AcVA-ZZ 和 AcVB-ZZ，其基因組序列長度分別為 7 654 和 7 454 nt（GenBank 登錄號分別為 MN022295 和 MN022296）。AcVA 和 AcVB 的基因組結(jié)構(gòu)與已報道的 AcVA 和 AcVB 基因組結(jié)構(gòu)相同，含 5 個開放閱讀框（ORF）。其中 ORF1編碼多聚蛋白，行使復(fù)制酶蛋白的功能。ORF2 編碼功能未知的假定蛋白，ORF3 編碼運動蛋白，ORF4 編碼外殼蛋白，ORF5 編碼 RNA 結(jié)合蛋白。本研究中獲得的 AcVA-ZZ 分離物與新西蘭報道的 TP7-93A 的全基因組同源率為 82.7%，5 個 ORF 的核苷酸和氨基酸序列同源率分別為 80.1% ~ 92.1%和 81.4% ~ 99.1%。本研究中獲得的 AcVB-ZZ 分離物的基因組與新西蘭報道的 TP7-93B 之間同源率為 78.5%，5 個 ORF 之間的核苷酸同源率為 69.2% ~ 89.9%，對應(yīng)的 5 個蛋白的同源率為72.2% ~ 97.6%。本研究中獲得的 AcVA-ZZ 和 AcVB-ZZ 分離物的 5 個 ORF 之間，均是 ORF2 變異最大，ORF1 和 ORF3 次之，ORF4 和 ORF5 則變異較小。
▲redkiwifruit獼猴桃▲
2.4 AcVA 和 AcVB 的分子變異
測定了來自周至（徐香、海沃德、華優(yōu)）、眉縣（徐香、海沃德、秦美）、楊凌（徐香、華優(yōu)、秦美）和漢中（海沃德、華優(yōu)、秦美）的 12 個 AcVA 外殼蛋白基因序列（GenBank 登錄號：MH457010 ~ MH457021），和來自周至（徐香、海沃德、華優(yōu)）、眉縣（徐香、海沃德、華優(yōu)）、楊凌（徐香、海沃德）和漢中（華優(yōu)、秦美）的 10 個 AcVB 外殼蛋白基因序列（GenBank 登錄號：MH457022 ~ MH457031）。如圖 2 所示，利用本研究中獲得的 12 個與之前在徐香獼猴桃上測定的 28 個和新西蘭報道的 2 個 AcVA 的外殼蛋白基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，42 條 AcVA 的外殼蛋白基因序列分為 2組，其中第 1 組又分為 2 個亞組。本研究中大多數(shù)分離物的序列聚集在第 2 組，少數(shù)聚集在第 1 組。如圖 3 所示，利用本研究獲得的 10 個與之前在徐香獼猴桃上測定的 16 個和新西蘭報道的 2 個AcVB 的外殼蛋白基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，28 個 AcVB 的外殼蛋白基因序列分為 2 組，其中第 1組又分為 2 個亞組。本研究中大多數(shù)分離物的序列聚集在第 1 組，少數(shù)聚集在第 2 組。
▲sungold g3 kiwifruit vine
3 討論
AcVA 和 AcVB 都是乙型線形病毒科葡萄病毒屬的成員。葡萄病毒屬目前已發(fā)現(xiàn)的病毒成員包括 AcVA 和 AcVB 在內(nèi)已有 14 個（Blouin et al.，2012）。該屬成員被報道的侵染對象主要是葡萄，而 AcVA 和 AcVB 是 Blouin 等（2012）首次在新西蘭獼猴桃上發(fā)現(xiàn)的。據(jù)報道，AcVA 和 AcVB 同時侵染中華獼猴桃時，癥狀表現(xiàn)為斑駁、褪綠和環(huán)斑等癥狀，當只有 AcVB 侵染中華獼猴桃時癥狀表現(xiàn)為系統(tǒng)輕斑駁（Blouin et al.，2012）。本研究中在陜西省調(diào)查發(fā)現(xiàn)無論是被 AcVA 和 AcVB 同時侵染，還是被其中 1 個單獨侵染的植株，癥狀均表現(xiàn)為葉片皺縮和褪綠的癥狀。僅從癥狀表現(xiàn)上難以區(qū)分該樣品是被單一病毒侵染還是被多個病毒混合侵染。
▲kiwifruit▲
之前在陜西省徐香獼猴桃上調(diào)查了 AcVA 和 AcVB 的帶毒率，分別為 40.5%和 35.5%（Zhao et al.，2019）。本研究中發(fā)現(xiàn)，AcVA 和 AcVB 在陜西周至、眉縣、楊凌和漢中不同產(chǎn)區(qū)的獼猴桃樣品中帶毒率不同，其中 AcVA 和 AcVB 分別在楊凌（36.7%）和眉縣（36.9%）的帶毒率最高。同時，AcVA和 AcVB 在陜西不同獼猴桃栽培品種上的帶毒率不同，均在徐香品種上最高，分別為 32.3%和 32.9%。在獼猴桃生產(chǎn)中，種植戶常常關(guān)注獼猴桃潰瘍病的危害，而忽略了獼猴桃病毒的存在，在嫁接過程中造成了獼猴桃病毒的大量傳播，致使獼猴桃病毒在陜西省有較高的帶毒率。在今后獼猴桃生產(chǎn)過程中，獼猴桃病毒病應(yīng)引起種植者的重視。尤其在獼猴桃栽培時，應(yīng)選用無毒苗，在嫁接時要確保砧木和接穗均無病毒。
由于 AcVA 和 AcVB 都只有一條全基因組的報道，無法用全基因組構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析全基因組的之前變異情況。本研究克隆并測定了多個 AcVA 和 AcVB 的外殼蛋白基因序列，分析了其分子變異情況，發(fā)現(xiàn)基于外殼蛋白基因的進化樹，AcVA 和 AcVB 均分為明顯的 2 個組，表明 AcVA 和AcVB 在陜西存在明顯的分子變異。
▲紅心獼猴桃果袋
AcVA 和 AcVB 均是葡萄病毒屬的成員，關(guān)于葡萄病毒屬成員的傳播介體，前人曾有過關(guān)于蚜蟲、蚧殼蟲、粉蚧殼蟲傳播葡萄病毒屬病毒的報道（Adams et al.，2012）。而在獼猴桃上可能傳播病毒的介體種類較少，目前還沒有傳播獼猴桃病毒介體的報道。因此，AcVA 和 AcVB 在田間可能主要通過嫁接傳播。
本研究結(jié)果表明，AcVA 和 AcVB 均在陜西省有廣泛的分布和較高的侵染率。從地區(qū)分布來看，AcVA 和 AcVB 分別在楊凌（36.7%）和眉縣（36.9%）的帶毒率最高。按照品種劃分，AcVA（32.3%）和 AcVB（32.9%）均在徐香品種上的帶毒率最高。本研究中還通過高通量測序與分析，分別獲得了AcVA 和 AcVB 中國分離物的基因組序列，它們與之前報道的 TP7-93A 和 TP7-93B 分離物對應(yīng)的同源率分別為 82.7%和 78.5%。AcVA 和 AcVB 外殼蛋白基因系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，2 種病毒均分成明顯的2 個組，存在較大的分子變異。本研究結(jié)果將為 AcVA 和 AcVB 遺傳進化和防治的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。關(guān)于 AcVA 和 AcVB 的生物學(xué)特性和致病性，還需要進一步的深入研究。
▲獼猴桃采收
Abstract：Kiwifruit（Actinidia spp.）viruses has seriously damaged kiwifruit production. This study investigated the incidence?and distribution of Actinidia virus A（AcVA）and Actinidia virus B（AcVB）in four major kiwifruit cultivars? （‘Xuxiang’，‘Hayward’，‘Huayou’and‘Qinmei’）grown in Shaanxi. The results showed that AcVA and AcVB were widely spread，with high infection rates in Shaanxi. Among the four main kiwifruit producing areas tested in this study，the highest infection rates for AcVA and AcVB were obtained in Yangling（36.7%）and Meixian（36.9%）. Among the four tested kiwifruit cultivars，the highest infection rates for AcVA（32.3%）and AcVB（32.9%）were obtained in‘Xuxiang’. This study conducted next-generation sequencing and obtained the genome sequence of AcVA-ZZ and AcVB-ZZ isolates which consisted of 7 654 and 7 454 nucleotides，respectively. The genomes of AcVA-ZZ and AcVB-ZZ isolates were 82.7% and 78.5% homologous with those of TP7-93A and TP7-93B isolates previously reported. Phylogenetic trees of AcVA and AcVB coat protein gene showed substantial sequence variations and therefore were considered as two distinct clades.
Keywords：Actinidia；Actinidia virus A；Actinidia virus B；genome；molecular variability；virus
detection
▲redkiwifruit獼猴桃
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