獼猴桃Psa-V檢測(cè)方法的研究

獼猴桃Psa-V檢測(cè)方法的研究
作者：劉蕓宏 陜西師范大學(xué)
摘要：獼猴桃潰瘍病是細(xì)菌性疾病,已嚴(yán)重危害到了中國(guó)乃至全球獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，已經(jīng)成為了全國(guó)森林植物的重點(diǎn)檢疫對(duì)象。丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)是引發(fā)獼猴桃潰瘍病的病原菌，Psa-V(Pseudomonas syringae pv.actinidiae virulent strains)是Psa中的強(qiáng)毒株，致病力強(qiáng),是導(dǎo)致我國(guó)獼猴桃潰瘍病爆發(fā)的主要病原菌。獼猴桃花粉攜帶Psa-V是導(dǎo)致其遠(yuǎn)距離傳播的重要因素。因此，加大對(duì)獼猴桃花粉中Psa-V檢測(cè)力度對(duì)防止獼猴桃潰瘍病的發(fā)生具有比較重要的意義。本研究采用普通PCR對(duì)陜西獼猴桃花粉樣品進(jìn)行Psa-V檢測(cè)，并建立利用PMA-qPCR以及RT-PCR對(duì)Psa-V活菌進(jìn)行檢測(cè)的方法，為花粉消毒,減少花粉傳播Psa-V提供技術(shù)支撐。

▲播宏果業(yè)正在給獼猴桃授粉

主要結(jié)果及結(jié)論如下：1.陜西獼猴桃產(chǎn)區(qū)商品花粉中Psa-V普通PCR檢測(cè)抽取36份商品花粉樣品采用普通PCR進(jìn)行Psa-V檢測(cè)。結(jié)果表明，共有27個(gè)樣品結(jié)果呈陽(yáng)性，陽(yáng)性概率為75%，對(duì)結(jié)果為陽(yáng)性的樣品進(jìn)行測(cè)序分析可得出，呈現(xiàn)出陽(yáng)性結(jié)果的27個(gè)樣品均為Psa-V。

▲獼猴桃雄花蕾

2.基于PMA-qPCR的Psa-V活菌檢測(cè)將疊氮溴化丙啶(PMA)與實(shí)時(shí)熒光定量(qPCR)相結(jié)合，建立陜西獼猴桃產(chǎn)區(qū)Psa-V活菌定量檢測(cè)方法。通過(guò)優(yōu)化PMA最佳濃度、暗育時(shí)間、曝光時(shí)間，確定PMA-qPCR區(qū)別潰瘍菌活、死菌的最佳條件，結(jié)果表明，Psa-V經(jīng)98.3℃沸水浴處理13min可完全致死，Psa-V死菌濃度為1×107 CFU/mL時(shí)PMA與死菌共價(jià)交聯(lián)的最佳濃度為105 ug/mL，最佳暗育時(shí)間為8 min，最佳曝光時(shí)間為20min，在此條件下死菌DNA無(wú)擴(kuò)增，而對(duì)活菌DNA擴(kuò)增無(wú)影響；Psa質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品建立的線性回歸方程是Y=-3.2204x+37.73,R2=0.9955，最低可檢出6.39×102拷貝/反應(yīng)體系的Psa-V；檢測(cè)限為2.38×102拷貝/μL反應(yīng)體系；應(yīng)用人工染菌后的枝條樣品檢測(cè)，則最低檢出限是6.30×104 CFU/mL，與菌落計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果相符。

▲播宏果業(yè)正在采摘獼猴桃雄花蕾

3.基于RT-PCR的Psa-V活菌檢測(cè)應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，建立陜西獼猴桃產(chǎn)區(qū)Psa-V活菌檢測(cè)方法。結(jié)果表明，RT-PCR法可有效檢測(cè)出Psa-V活菌,在純培養(yǎng)物中，最小檢出限為1.26×104拷貝/μL反應(yīng)體系；對(duì)于染菌花粉樣品，增菌12h，靈敏度可達(dá)1.39×101 CFU/g

▲遵義市播宏獼猴桃果園有限公司是西南地區(qū)最大的獼猴桃果業(yè)公司，種植1200畝高山獼猴桃，是遵義市農(nóng)業(yè)龍頭企業(yè)，市級(jí)先進(jìn)扶貧企業(yè)。其中獼猴桃花粉項(xiàng)目是中國(guó)單體面積最大的獼猴桃花粉園，單體采粉園達(dá)到了400畝，豐產(chǎn)期產(chǎn)花粉400公斤，提供高品質(zhì)、高倍體、高活性的獼猴桃花粉，可以滿足30000畝果園的花粉需要。聯(lián)系微信18030405084

▲yellow Kiwifruit