摘 要：為鑒定獼猴桃果實(shí)貯藏過程中參與果膠降解的關(guān)鍵酶多聚半乳糖醛酸酶（PG）基因，以‘徐香’獼猴桃為試材，利用轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）和實(shí)時(shí)熒光定量（qRT-PCR）技術(shù)，研究了獼猴桃 PG基因在不同成熟進(jìn)程及外源乙烯誘導(dǎo)后果實(shí)中的表達(dá)變化。根據(jù) RNA-seq 結(jié)果，可以將 37 個(gè) PG 基因在采后不同時(shí)期的表達(dá)趨勢分為 4 類，Achn325011、Achn240441、Achn071601 和 Achn100411，分別在采后 2、4、6 和 8 d 有表達(dá)高峰。鑒于果實(shí)硬度在常溫貯藏 6 d 較 4 d 時(shí)急劇下降，因此利用 qRT-PCR 重點(diǎn)驗(yàn)證了其中的 2 類 14 個(gè)基因，發(fā)現(xiàn) 4 個(gè)基因在采后 2 d 和 4 d 明顯上調(diào)，與果實(shí)硬度在 6 d 時(shí)的下降相關(guān)。進(jìn)一步利用外源乙烯處理果實(shí)，發(fā)現(xiàn)其中 1 個(gè)基因 Achn071601 在處理與對(duì)照果實(shí)中的差異表達(dá)與同時(shí)期果實(shí)硬度的變化趨勢一致，是獼猴桃關(guān)鍵的 PG 基因。
關(guān)鍵詞：獼猴桃；貯藏；轉(zhuǎn)錄組測序；PG 基因
▲獼猴桃結(jié)果像葡萄一樣多了
獼猴桃是典型的呼吸躍變型果實(shí)，有明顯的生理后熟過程，采后果實(shí)質(zhì)地易軟化，影響其商品性（許淼 等，2017）。因此，探討獼猴桃果實(shí)成熟軟化機(jī)理具有重要意義。研究表明，果實(shí)后熟過程中的硬度下降與細(xì)胞壁相關(guān)酶的活性有關(guān)，因此在生產(chǎn)中常用外源藥劑處理抑制獼猴桃采后果實(shí)中這些酶的活性，從而延長貯藏期（丁建國 等，2003；李佩燕 等，2013；李樺 等，2017）。陳昆松等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，獼猴桃果實(shí)采收時(shí)，β–半乳糖苷酶基因表達(dá)水平最高，隨后呈下降趨勢。雖然 β–半乳糖苷酶基因的表達(dá)可為外源乙烯所誘導(dǎo)，但在果實(shí)乙烯躍變期間卻沒發(fā)現(xiàn) β–半乳糖苷酶基因顯著的表達(dá)變化。Zhang 等（2006）利用獼猴桃表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫克隆了脂氧合酶 Lox 基因家族 6 個(gè)成員，發(fā)現(xiàn)它們在獼猴桃果實(shí)成熟過程中具有不同的表達(dá)譜，AdLox1 和 AdLox5 對(duì)乙烯敏感，表達(dá)水平隨果實(shí)內(nèi)源乙烯積累趨于增強(qiáng)，與 Lox 酶活性表現(xiàn)一致；同樣，這兩個(gè)基因表達(dá)可被外源乙烯所誘導(dǎo)，而其余 4 個(gè)成員則對(duì)乙烯不敏感。楊紹蘭等（2007）克隆了獼猴桃的 α-expansin（EXP）基因，Northern 雜交結(jié)果表明 AdEXP1 在采收當(dāng)天的果實(shí)中表達(dá)很弱，隨著果實(shí)成熟衰老進(jìn)程加快而表達(dá)趨于增強(qiáng)。
▲獼猴桃包裝盒
多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）是果膠酶的一種，通過催化果膠分子的解聚，促進(jìn)果實(shí)軟化（魏瀟 等，2011）。目前關(guān)于 PG 活性增強(qiáng)與果實(shí)成熟軟化的關(guān)系已經(jīng)在番茄、蘋果（劉靜軒 等，2017）、梨、葡萄、桃、柿（宋康華 等，2010）和香蕉等多個(gè)樹種上得到證實(shí)，也在這些樹種上分離出了大量 PG 基因（高曉銘 等，2016）。在獼猴桃上，Wang 等（2000）克隆了 3 個(gè) PG基因 CkPGA、CkPGB 和 CkPGC，其中 CkPGA 和 CkPGB 在果實(shí)和花瓣上均有表達(dá)，而 CkPGC 則僅在成熟果實(shí)表達(dá)，其表達(dá)量可以達(dá)到 CkPGA 和 CkPGB 的 50 倍。陳義挺等（2017）以‘米良 1號(hào)’獼猴桃果實(shí)為材料，研究了室溫、低溫和脫落酸處理下獼猴桃果實(shí)硬度的變化，同時(shí)對(duì) AcPG的表達(dá)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn) AcPG 參與了獼猴桃果實(shí)軟化過程。
▲獼猴桃開花授粉
隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）作為一種高效便捷的基因表達(dá)分析手段，在不少研究中得到廣泛應(yīng)用。高潔（2013）利用轉(zhuǎn)錄組測序?qū)?span id="63c5byj" class='wp_keywordlink'>黃肉獼猴桃‘金豐’果實(shí)著色過程中相關(guān)差異基因的表達(dá)進(jìn)行了解析，發(fā)現(xiàn)果實(shí)成熟期與轉(zhuǎn)色期之間有 1 457 個(gè)差異表達(dá)基因，其中 12個(gè)調(diào)控葉綠素合成及 14 個(gè)調(diào)控類胡蘿卜素合成的基因可能與該黃肉獼猴桃的呈色機(jī)理有關(guān)。Tang等（2017）對(duì)獼猴桃雄性和雌性花進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，共鑒定出 2 503 個(gè)差異表達(dá)的基因，其中 1 793個(gè)基因在雌花中表現(xiàn)為上調(diào)，710 個(gè)下調(diào)。
▲正在采摘獼猴桃雄花
目前獼猴桃的 PG 基因多數(shù)從表達(dá)序列標(biāo)簽庫或者同源序列克隆獲得，可能導(dǎo)致鑒定到的基因并不全面。為了從轉(zhuǎn)錄組水平研究 PG 基因與獼猴桃果實(shí)硬度變化的關(guān)系，以中國獼猴桃主栽品種‘徐香’為試材，在果實(shí)成熟后進(jìn)行常溫貯藏，對(duì)貯藏后不同時(shí)期的果肉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定其中 PG 基因的表達(dá)，并分析 PG 與硬度變化的關(guān)系，為發(fā)掘獼猴桃中果實(shí)質(zhì)地性狀形成相關(guān)的 PG 基因，解析獼猴桃果實(shí)成熟軟化的分子機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)。
▲獼猴桃苗
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料及其貯藏期間果實(shí)硬度測定
2016 年 9 月，自獼猴桃主產(chǎn)區(qū)河南省西峽縣一商品果園采摘 6 年生‘徐香’獼猴桃（Acinidiachinensis）大小一致、無病蟲害的成熟果實(shí)，迅速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，常溫貯藏（25 ℃、濕度約 60%）。
貯藏 2、4、6 和 8 d，分別取 6 ~ 8 個(gè)果實(shí)，去皮，采用 FT327 型果實(shí)硬度計(jì)（Fruit TestTM，意大利）測定果實(shí)去皮硬度，隨后取混合果肉至液氮冷凍后–80 ℃保存，供提取 RNA。
1.2 外源乙烯處理試驗(yàn)
2017 年 10 月，采摘獼猴桃果實(shí)，以乙烯利（購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所果樹生長發(fā)育調(diào)控中心）為外源乙烯處理的試劑（濃度為 500 mg · kg-1），浸果 3 min，取出晾干，室溫保存。在處理后 1 ~ 7 d，每天采用 TA-XT plus 型質(zhì)構(gòu)儀（Stable Micro Systems，英國）測定果實(shí)去皮硬度，探頭直徑 5 mm，測定速度 2.0 mm · s-1，下降位移 5.0 mm。另取樣冷凍保存?zhèn)溆锰崛?RNA。
1.3 RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄
利用多糖多酚植物 RNA 提取試劑盒（華越洋公司，北京）提取果肉 RNA，加 DNaseⅠ（TaKaRa公司，大連）去除 DNA，利用瓊脂糖電泳和 NanoDrop 2000（Thermo，Waltham，MA，USA）檢測RNA 的純度，利用 Ist Strand cDNA Synthesis Kit（TAKARA 公司，大連）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成單鏈 cDNA。
▲Golden Kiwi
1.4 RNA-seq
利用單鏈 cDNA、dNTPs、RNase H 和 DNA polymeraseⅠ合成雙鏈 cDNA，添加接頭，純化并構(gòu)建測序文庫，在 HiSeq 2500（Illumina，San Diego，CA，USA）上進(jìn)行測序，試劑全部來自 Illumina公司。測序結(jié)果去除接頭和低質(zhì)量序列后，利用 TopHat 2（Kim et al.，2013）軟件將序列比對(duì)至參考基因組（Huang et al.，2013），基因表達(dá)量采用 FPKM（Fragments per kb per million reads）值表示。
1.5 熒光定量 PCR 驗(yàn)證
根據(jù)果實(shí)硬度的變化，選擇 14 個(gè)在采后處理中期有明顯上調(diào)的基因采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qRT-PCR）法進(jìn)行 RNA-seq 結(jié)果的驗(yàn)證，目的基因和內(nèi)參 Actin 基因特異引物見表 1。qRT-PCR 反應(yīng)試劑盒購自 TaKaRa 生物技術(shù)公司，按照說明書添加適量的 cDNA 模板、引物和熒光染料，在 ABI7900HT 實(shí)時(shí)定量 PCR 儀（ABI，Carlsbad，CA，USA）上進(jìn)行反應(yīng)。程序?yàn)?95 ℃3 min；95 ℃ 3 s，60 ℃ 20 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。參考 Livak & Schmittgen（2001）的方法，根據(jù)原始 Ct 值計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。
▲zespri yellow kiwi
2 結(jié)果與分析
2.1 PG 基因在染色體上的分布
獼猴桃有 29 條染色體，根據(jù)基因組功能注釋結(jié)果（Huang et al.，2013），PG 基因共 37 個(gè)，分布在 17 條染色體（圖 1），其中第 17 號(hào)染色體有 4 個(gè)，第 6、7、12、18 和 20 號(hào)染色體各有 3 個(gè)，其他染色體上分布的較少。PG 基因在單個(gè)染色體上的分布也沒有明顯規(guī)律，在第 6、7、11、13、15、17、18 和 20 號(hào)染色體上存在 2 個(gè)基因成對(duì)排列的現(xiàn)象，其余基因則彼此之間距離較遠(yuǎn)。
2.2 常溫貯藏過程中果實(shí)硬度的變化
如圖 2 所示，常溫貯藏 2 d 和 4 d，果實(shí)硬度差異不大，4 d 時(shí)為 13.56 kg · cm-2。隨著貯藏時(shí)間的延長，果實(shí)硬度明顯下降，貯藏 6 d時(shí)果實(shí)硬度為 2.01 kg · cm-2，僅為貯藏初期的14.8%；貯藏 8 d 與 6 d 時(shí)相比變化不明顯。
▲紅心獼猴桃套果袋
2.3 常溫貯藏過程中 PG 基因的表達(dá)變化在果實(shí)貯藏過程中，轉(zhuǎn)錄組測序共檢測出25 109 個(gè)表達(dá)的基因。其中貯藏 2 d 時(shí)表達(dá)基因最多，達(dá)到 22 939 個(gè)；4 d 和 8 d 表達(dá)基因分別有 22 156 和 22 165 個(gè)；而 6 d 時(shí)（果實(shí)硬度顯著下降）表達(dá)基因最少，僅有 21 670。根據(jù) PG基因的全基因組注釋，37 個(gè) PG 基因中，僅有 28個(gè)基因檢測到有表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，這 28 個(gè)基因在不同貯藏期的相對(duì)表達(dá)量變化如圖 3 所示。根據(jù) 28 個(gè) PG 基因在貯藏后不同時(shí)期的表達(dá)趨勢，將它們分成 4 類（圖 3），即 1、2、3、4類基因分別在貯藏 6、8、2 和 4 d 有明顯表達(dá)。由于獼猴桃果實(shí)硬度在貯藏 2 和 4 d 差異不大，6和 8 d 之間差異也不明顯，僅在 6 d 有明顯下降。鑒于基因表達(dá)變化可能出現(xiàn)在表型變化之前，所以推測第 1 類（貯藏 6 d 明顯表達(dá)）和第 4 類（貯藏 4 d 明顯表達(dá)）基因可能與果實(shí)的硬度下降相關(guān)。
為驗(yàn)證 RNA-seq 得到的基因表達(dá)結(jié)果，選擇第 1 類中的 6 個(gè)基因（Achn080501、Achn208711、Achn071601 、 Achn228271 、 Achn032311 和Achn144331）和第 4 類的 8 個(gè)基因（Achn032321、Achn240441 、 Achn114381 、 Achn184431 、Achn057911 、 Achn236671 、 Achn118371 和Achn100771）進(jìn)行了 qRT-PCR 分析（圖 4）。
▲Health Benefits of Kiwi Fruit
從 圖 4 可以看出， 3 個(gè) 第 1 類基因（Achn208711、Achn228271 和 Achn032311）和4 個(gè)第 4 類基因（Achn032321、Achn057911、Achn236671 和 Achn118371），利用 RNA-seq 得到的基因 FPKM 值均小于 1，表明該類基因表達(dá)量非常低，暗示其可能不是導(dǎo)致果實(shí)硬度降低的關(guān)鍵基因。另外的 3 個(gè)第 1 類基因（Achn080501、Achn071601 和 Achn144331）和 4 個(gè)第 4 類基因（ Achn240441 、Achn114381 、 Achn184431 和Achn100771），利用 RNA-seq 所得到的基因 FPKM 值均大于 1，與利用 qRT-PCR 得到的基因相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性分別為–0.193、0.996、0.931、–0.309、0.431、0.999 和 0.747，即除了 Achn080501和Achn240441之外，其余基因的表達(dá)結(jié)果在兩種方法間是比較一致的。其中，第4類基因Achn184431利用 qRT-PCR 和 RNA-seq 得到的相對(duì)表達(dá)量在貯藏第 4 天分別是第 2 天的 1.75 倍和 2.00 倍，而第4類基因Achn240441利用qRT-PCR和RNA-seq得到相對(duì)表達(dá)量在貯藏后第4天分別為第2天的0.94倍和 2.58 倍；2 個(gè)第 1 類基因 Achn071601 和 Achn144331 在 6 d 也較 4 d 明顯上調(diào)，利用 qRT-PCR得到的相對(duì)表達(dá)量分別達(dá)到 8.41 倍和 7.81 倍；該結(jié)果暗示這 4 個(gè)基因可能是導(dǎo)致‘徐香’獼猴桃果實(shí)硬度下降的關(guān)鍵基因。
▲sungold g3 陽光金果
2.4 外源乙烯對(duì) PG 基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用
PG 基因的表達(dá)通常受到乙烯的誘導(dǎo)（陳昆松 等，2000；Zhang et al.，2006）。對(duì)照果實(shí)在貯藏 1 d 和 5 d 時(shí)硬度快速下降，其他時(shí)期相對(duì)穩(wěn)定；而外源乙烯處理的果實(shí)硬度持續(xù)下降（圖 5）。
外源乙烯處理后的果實(shí)，上述 4 個(gè)表達(dá)差異較大的基因的表達(dá)變化如圖 6 所示。對(duì)照果實(shí)的 Achn184431 基因在貯藏 4 d 時(shí)有 1 個(gè)明顯的高峰，而外源乙烯處理的 Achn184431則隨著貯藏期的延長呈下降趨勢。在整個(gè)貯藏期，Achn184431 的表達(dá)量雖然在對(duì)照與處理間的個(gè)別時(shí)期差異不明顯，但總體趨勢顯示對(duì)照均高于乙烯處理，表明其不受外源乙烯的誘導(dǎo)。
▲紅心獼猴桃果園
對(duì)照的 Achn240441 基因在處理后 4 d 時(shí)有 1 個(gè)強(qiáng)度不明顯的表達(dá)高峰，而乙烯處理的Achn240441 的表達(dá)量峰值出現(xiàn)在 2 d 時(shí)。比較對(duì)照與處理果實(shí)中該基因的表達(dá)，顯示在貯藏 2 ~ 6 d內(nèi)，對(duì)照高于處理，說明其與同時(shí)期處理的果實(shí)硬度下降無關(guān)。對(duì)照的 Achn144331 基因在貯藏 4 d 時(shí)出現(xiàn)表達(dá)高峰，而乙烯處理的果實(shí)貯藏 2、4 和 6 d 均低于對(duì)照，最高值出現(xiàn)在貯藏 7 d 時(shí)。由于外源乙烯處理與對(duì)照果實(shí)硬度變化最明顯的差異出現(xiàn)在乙烯處理后 4 d，因此，該基因在貯藏 7 d 的高表達(dá)可能與外源乙烯誘導(dǎo)無關(guān)。
Achn071601 基因在對(duì)照果實(shí)貯藏 6 d 時(shí)出現(xiàn)表達(dá)高峰，而在處理果實(shí)中隨著貯藏時(shí)間的延長呈上升趨勢，在 7 d 時(shí)表達(dá)最高。比較其在對(duì)照和處理果實(shí)中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)從采后 2 d 開始，Achn071601在處理果實(shí)的表達(dá)均高于對(duì)照，與同期果實(shí)硬度在處理和對(duì)照果實(shí)間的差異一致，暗示其可能是導(dǎo)致果實(shí)硬度下降的原因。
▲獼猴桃檢測活性
3 討論
在獼猴桃基因組測序和注釋完成之前，對(duì)關(guān)鍵基因的克隆多使用圖位克隆或者同源克隆的方法。圖位克隆依賴遺傳圖譜的構(gòu)建和精細(xì)定位，進(jìn)展緩慢；而同源克隆則可能只克隆到某個(gè)基因家族中的部分成員，遺漏全基因組的信息。如 Wang 等（2000）在獼猴桃中克隆的 3 個(gè)基因 CkPGA、CkPGB 和 CkPGC，分別對(duì)應(yīng)獼猴桃基因組 Achn124031、Achn080501 和 Achn051381 基因。在本研究中，Achn124031 在‘徐香’獼猴桃果實(shí)中不表達(dá)，Achn080501 雖然有表達(dá)，但表達(dá)量較低，且qRT-PCR 顯示其在整個(gè)果實(shí)貯藏過程中變化不明顯；Achn051381 在果實(shí)貯藏 6 d 有表達(dá)，且隨著貯藏時(shí)間的延長持續(xù)上調(diào)，趨勢與 Wang 等（2000）的結(jié)果類似。然而 Achn051381 基因在貯藏 8 d 的FPKM 值僅為 1.33，表達(dá)量遠(yuǎn)小于同時(shí)期本研究新鑒定的 2 個(gè)關(guān)鍵基因，如 Achn071601（59.18）和 Achn144331（10.25）。陳義挺等（2017）根據(jù)獼猴桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫克隆到 1 個(gè) PG 基因 AcPG，該基因在獼猴桃‘米良 1 號(hào)’果實(shí)室溫貯藏 7 d 后表達(dá)水平急劇下降至貯藏前的 1/5。本研究中發(fā)現(xiàn)AcPG 基因?qū)?yīng) Achn118371，雖然 qRT-PCR 表明其在‘徐香’獼猴桃果實(shí)貯藏 6 d 后同樣較貯藏 2 d同樣有明顯下調(diào)，但表達(dá)量較低，可能并不是導(dǎo)致‘徐香’獼猴桃果實(shí)硬度下降的關(guān)鍵基因。
▲獼猴桃雄花展示
獼猴桃基因組測序于 2013 年完成（Huang et al.，2013），為全面系統(tǒng)地研究基因家族的所有成員提供了重要的基礎(chǔ)。在本研究中，基于基因組注釋結(jié)果可以看出，PG 基因共有 37 個(gè)，遠(yuǎn)多于前人研究中所涉及的 PG 基因數(shù)量。利用 RNA-seq 結(jié)合 qRT-PCR 技術(shù)，本研究初步篩選出 4 個(gè)表達(dá)量較高且在果實(shí)常溫貯藏條件下硬度變化關(guān)鍵期發(fā)生明顯上調(diào)的 PG 基因；進(jìn)一步通過外源乙烯處理獼猴桃果實(shí)，發(fā)現(xiàn)其中 Achn071601 的誘導(dǎo)表達(dá)與果實(shí)硬度的變化密切相關(guān)。
綜上所述，本研究利用 RNA-seq 技術(shù)從轉(zhuǎn)錄組層面鑒定出 4 個(gè)與果實(shí)硬度變化相關(guān)的 PG 基因，通過外源乙烯處理則推測 Achn071601 可能是‘徐香’獼猴桃中調(diào)控果實(shí)貯藏期果實(shí)硬度變化的重要候選基因。
▲獼猴桃電動(dòng)授粉槍
Abstract：RNA-sequence and real-time quantitative polymerase chain reaction（PCR）technique （qRT-PCR）were used to identify the expression of key polygalacturonase（PG）genes involved in pectin degradation in kiwifruit，stored at room temperature at different time periods during storage. The expression pattern of 37 PG genes could be divided into 4 groups according to the RNA-sequence results of different samples stored at room temperature. For example，Achn325011，Achn240441，Achn071601 and Achn100411 genes present a peak expression at 2，4，6 and 8 days after harvest. Fourteen PG genes belonging to groups 1 and 4 were verified using the qRT-PCR as a decrease in fruit firmness on the 6 d after storage was observed. Among these PG genes，the expression of 4 genes was related to the fruit firmness change. Moreover，the expression of these 4 genes was also evaluated in kiwifruits treated with exogenous ethylene. The results of ethylene treatment showed that the expression of a single gene called Achn071601 was consistent with the fruit firmness change during the storage period. Therefore，Achn071601 should be considered as a key PG gene in kiwifruit.
Keywords：kiwifruit；storage；RNA-seq；PG gene
▲新西蘭的獼猴桃雄花園Kiwi Male Garden in New Zealand
評(píng)論